Для молодих вчених за 2015 р. Розробка та біо-тестування нових сполук з противірусною та протипухлинною активністю

Панчук ростислав русланович – науковий співробітник Інституту біології клітини нан україни
Для молодих вчених за 2015 р. Розробка та біо-тестування нових сполук з противірусною та протипухлинною активністю

Скачати 185.25 Kb.

Дата конвертації 18.04.2016 Розмір 185.25 Kb. НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

НА ЗДОБУТТЯ ЩОРІЧНОЇ ПРЕМІЇ ПРЕЗИДЕНТА УКРАЇНИ
ДЛЯ МОЛОДИХ ВЧЕНИХ ЗА 2015 р.
«Розробка та біо-тестування нових сполук з противірусною
та протипухлинною активністю
»
РЕФЕРАТ

ПОДАЄТЬСЯ АВТОРСЬКИМ КОЛЕКТИВОМ У СКЛАДІ:
ПАНЧУК РОСТИСЛАВ РУСЛАНОВИЧ – науковий співробітник Інституту біології клітини НАН України НАН України
МАЛЮКІНА МАРГАРИТА ЮРІЇВНА – молодший науковий співробітник відділу нанокристалічних матеріалів Інституту сцинтиляційних матеріалів НАН України
ГАВРИЛЮК ДМИТРО ЯРОСЛАВОВИЧ – доцент кафедри фармацевтичної, органічною і біоорганічної хімії Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького
БОГОРАД-КОБЕЛЬСЬКА ОЛЕНА СЕРГІЇВНА – провідний інженер відділу проблем інтерферону і імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Одною з найбільш актуальних проблем сучасної медицини є швидкий розвиток набутої стійкості збудників бактеріальних та вірусних інфекцій до лікарських засобів, що суттєво знижує ефективність терапії хворих та погіршує прогноз перебігу захворювання. Саме тому розробка новітніх імуномодуляторних засобів широкого спектру дії, які безпосередньо стимулюють продукцію інтерферонів у клітинах-мішенях, та володіють вищою активністю у порівнянні з комерційно доступними лікарськими засобами (такі як Таміфлю, Афлубін, Аміксин), є важливим завданням сучасної медицини.

Аналогічна, однак ще більш складна ситуація має місце у пацієнтів із злоякісними новоутвореннями, де множинна резистентність пухлин до ліків спостерігається у понад 50% пацієнтів вже за рік після проходження першого курсу хіміотерапії. Незважаючи на значний прогрес у цій галузі та величезні кошти (кількадесят мільярдів доларів США), які спрямовуються фармацевтичними компаніями на створення новітніх ліків, які б долали набуту стійкість пухлин до хіміотерапії, результати цих капіталовкладень є вельми скромними. Кілька препаратів цього класу, які пройшли І та ІІІ фазу клінічних досліджень на добровольцях (зокрема, Іксабепілон®, ларотаксел®), демонструють невисоку протипухлинну активність у порівнянні із золотими стандартами хіміотерапії. Таким чином, дизайн, синтез та біо-тестування новітніх протипухлинних препаратів, здатних не лише долати набуту стійкість пухлин до ліків, але й проявляти високу терапевтичну активність, залишається актуальним питанням органічної хімії, фармакології та клітинної біології.

Оксидативний стрес є неодмінним фактором, що супроводжує перебіг абсолютної більшості патологічних станів та захворювань людини. Зокрема, зростання продукції активних форм кисню спостерігається при запальних процесах, вірусних захворюваннях, а при бактеріальних інфекціях саме АФК є основним діючим фактором, що знищує чужорідні елементи у лізосомах фагоцитів та макрофагів. Не менше значення активні форми кисню відіграють і при перебігу злоякісних захворювань. Як відомо, усі без виключення злоякісні клітини характеризуються зниженням рівня окисного фосфорилювання та функціонування мітохондрій, що супроводжується підвищеним рівнем продукції АФК. Однак саме ця особливість злоякісних клітин водночас є і їх ахіллесовою п’ятою, оскільки будь-яке подальше зростання рівня АФК призводить до неминучої загибелі пухлинних клітин. Не дивно, що більшість протипухлинних препаратів, які застосовуються у клінічній медицині, вбивають злоякісні саме цим шляхом. Однак в ряді випадків надмірна продукція АФК за дії ліків, навпаки, може відіграти шкідливу роль для організму пацієнта. Зокрема, при перебігу ВІЛ/СНІД надмірна продукція інтерферону-гамма призводить до продукції неоптерину моноцитами, оксидативного стресу та деградації триптофану, які і є основними чинниками різкої втрати ваги, анемії та імунодефіциту. В свою чергу, тяжкі побічні ефекти від застосування протипухлинного препарату доксорубіцину (кардіо- та нефротоксичність) пояснюються саме продукцією високотоксичних гідроксил-радикалів за дії цього препарату у клітинах серця, нирок та печінки, до яких вони є особливо чутливими. Отже, ретельний контроль за продукцією АФК дозволить суттєво поліпшити ефективність лікування цих гетерогенних захворювань.

Метою даного циклу робіт було: 1) розробити новітні і зручні тест-системи для експрес-вимірювання впливу чинників на продукцію АФК та функціональний стан мітохондрій клітин ссавців на основі сучасних біохімічних методів, 2) перевірити їх ефективність на моделі оксидативного стресу у гепатоцитах людини, із застосуванням новітніх антиоксидантів та цитопротекторів, 3) вивчити взаємозв’язки між функціональним станом мітохондрій та продукцією інтерферонів клітинами ссавців за дії новітніх сполук із противірусною активністю; 4) з допомогою методів молекулярного моделювання розробити новітні протипухлинних препаратів на основі 4-тіазолідонів та провести їх синтез за допомогою сучасних методів органічної хімії; 5) провести біо-тестування досліджуваних сполук на модельних лініях злоякісних клітин з різними механізмами стійкості до ліків, їх вплив на функціональний стан мітохондрій, продукцію різних видів АФК та активацію сигнальних шляхів апоптозу та 6) дослідити ефекти від комбінаторного застосування новітніх нанокомпозитів із антиоксидантною активністю разом із протипухлинним препаратом доксорубіцином на продукцію активних форм кисню in vitro та його терапевтичний ефект in vivo на моделях експериментальних пухлин у мишей.

Наукова новизна циклу робіт: вперше показано, що похідні дифенілу за своїми інтерфероніндукуючими властивостями не поступаються відомому клінічному препарату аміксину, однак мають значно нижчу токсичність і широкий діапазон діючих концентрацій. Показано, що ці сполуки успішно пригнічують реплікацію РНК- і ДНК-вмісних вірусів як в культурі клітин, так і в організмі експериментальних тварин, а їх інтерферон-індукуюча активність зумовлена впливом цих сполук на мембранний потенціал мітохондрій та подальшого запуску сигнальних шляхів, задіяних у активації продукції інтерферонів. Вперше розроблено новітні протипухлинні препарати на основі похідних 4-тіазолідонів, проведено їх синтез та показано, що хімічна структура замісника у 5-му положенні цих сполук має вирішальний вплив на швидкість та рівень продукції су пероксид-аніонів за їх дії у мітохондріях клітин-мішеней. «Гібридні» 4-тіазолідони, які призводять до ранньої продукції АФК, призводять до швидшої та потужнішої індукції апоптозу у клітинах-мішенях у порівнянні з «материнськими» сполуками, які не володіють АФК-індуцибельною активністю. Апробовано технологію синтезу біологічно нетоксичних наночастинок на основі діоксиду церію та продемонстровано їх унікальну здатність в десятки разів посилювати антивірусну дію інтерферонів, що має надзвичайно важливе клінічне значення. Виявлено, що новітні наночастинки на основі діоксиду церію володіють потужною антиоксидантною активністю, та здатні пригнічувати продукцію токсичних супероксид-аніонів за дії протипухлинного препарату доксорубіцину на культурі клітин in vitro, та знижувати побічні ефекти цього антибіотику in vivo у мишей. Іммобілізація доксорубіцину на ще одному типу наночастинок на основі фулерену С60 дозволила знизити побічні ефекти дії цього лікарського засобу з одночасним посиленням його протипухлинної дії на моделі карциноми Льюїс у мишей. Результати, отримані в ході виконання даного циклу робіт, мають важливе фундаментальне та прикладне значення, оскільки можуть лягти в основу ліків вітчизняного виробництва з широким спектром біологічної активності, зокрема, противірусною та протипухлинною. Відповідні розробки авторів захищені 6 патентами України.

Відомо, що до числа найбільш чутливих параметрів, що застосовуються для інтегральної оцінки функціонального стану клітин, відносять величини трансмембранних потенціалів – клітинного (ΔΨр) і мітохондріального(ΔΨm) (Graf J., 1996; Shapiro H.M., 2000), які не тільки пов’язані із загальним рівнем метаболічної активності клітини, але їх зміни також можуть відображати динаміку клітинної активації при дії агоністів (Lee S. et al, 1992).

Безпосередньо вимірювати потенціал поодиноких клітин і мітохондрій in situ дозволив використаний метод оцінки локальних змін флуоресценції зондів (потенціал-чутливого карбоціанінового барвника DiOC2). Доведено, що застосування спеціальних методів флуоресцентної мікроскопії для розрахунку абсолютних значень плазматичного потенціалу (ΔΨр = -39.9 ± 2.63 mV) із допомогою зонда не відрізняється від даних, отриманих іншими дослідниками (Terasaki M. et al., 1984; Sawanobori T. et al., 1989).

Показано, що мікрофлуориметрична оцінка накопичення агрегатів зонду JC-1 та їх руйнування під впливом протонофора FCCP в мітохондріях гепатоцитів in situ є чутливим параметром, який можна використовувати для оцінки функціональної активності мітохондрій.

Різноманітність процесів в біомембранах значною мірою визначається фізичними властивостями ліпідного бішару – поверхневим зарядом, ступенем гідратації, плинністю, здатністю до фазових переходів, дипольним потенціалом. У свою чергу ці властивості змінюються в залежності від складу компонентів мембрани, їх співвідношення і взаємодії на молекулярному рівні. Оскільки спектрально-люмінесцентні характеристики обраних поліметинових зондів чутливі до змін мікрооточення хромофора, оцінка флуоресцентних властивостей барвників при зв’язуванні з клітинними мембранами дозволяє судити про переважну молекулярну локалізацію хромофорної частини молекули зонду, а також про можливі структурно-функціональні перебудови біомембран в процесі адаптації клітин до зовнішніх впливів.

Використання поодиноких гепатоцитів для отримання спектрів флуоресценції барвників (DiOC2, SqSС4 і JC-1) дозволило позбавитися ансамблевого усереднення та виявити особливості змін мембранного потенціалу клітин у часі. Такий підхід дозволив оцінити за допомогою потенціал-чутливих зондів не тільки абсолютні значення плазматичного потенціалу гепатоцитів, але і його зміни в процесі клітинної відповіді на дію зовнішніх чинників.

В рамках проведених досліджень показано, що використана клітинна тест-система поодиноких гепатоцитів щура дозволяє проводити моніторинг стану клітин при зміні параметрів іонної провідності, оцінювати збереження ланок у ланцюзі внутрішньоклітинної сигналізації і може бути використана для оцінки функціонального стану клітин після дії різних зовнішніх факторів та виявлення сублетальних (на рівні сприйняття і передачі сигналу) пошкоджень клітин. Чутливість розробленої тест-системи до змін окислювального статусу клітин була показана нами із застосуванням прооксидантів у різних концентраціях. За допомогою даного підходу також показано захисний ефект глутатіону, який запобігає порушенню мітохондріальної функції під впливом окислювачів.

Такий ефект може бути пояснений визначальною роллю редокс потенціалу GSH у характері змін ΔΨм. Відомо, що редокс статус GSH впливає на швидкість утворення АФК мітохондріями, зміни абсолютної концентрації GSH і GSSG, а також їх співвідношення GSH/GSSG відіграють важливу роль у механізмах регуляції оборотних змін ΔΨм або запуску його незворотного зниження. Мітохондріальними мішенями, регуляція яких пов’язана із змінами редокс статусу глутатіону, є аденіннуклеотидтранслоказа (ANT), іонні канали (IMAKiPTP). Тому стабілізація ΔΨм під впливом екзогенного глутатіону після заморожування-відігрівання клітин сприяє більш повному відновленню функціональної активності мітохондрій. З іншого боку регуляторний вплив відновленого глутатіону за рахунок захисту іон-транспортних систем плазматичної мембрани, що є чутливими до дії оксидативного стресу, відновлює всі ланки процесу передавання сигналу з плазматичної мембрани до ефекторних систем клітини, у тому числі мітохондрій.

Оскільки відомо, що саме мітохондрії крім енергетичного забезпечення клітини, приймають участь у клітинних реакціях вродженого антивірусного імунітету у ссавців, зокрема каскадної відповіді, завершальним етапом якої є продукція інтерферонів І типу, було досліджено вплив на стан мітохондрій сполук індукторів інтерферону. Цілеспрямований пошук новітніх лікарських препаратів призвів до виявлення нових індукторів ІФН серед низькомолекулярних сполук, що відносяться до похідних дифенілу. Обрані сполуки – похідні дифенілу – близькі за структурою та біологічними властивостями до лікарського препарату Аміксину IC, проте характеризуються порушеною планарністю структури. Завдяки цьому сполуки проявляють значну нижчу токсичність в живих об’єктах, оскільки виявляються нездатними до інтеркаляції у нуклеїнові кислоти клітини-господаря.

Проведене вивчення інтерфероногенних властивостей похідних дифенілу виявило, що за своїми інтерфероніндукуючими властивостями сполуки не поступаються аміксину, а їх перевагами є низька токсичність і широкий діапазон інтерфероногенних концентрацій. Показано, що обрані сполуки проявляють противірусну активність як в культурі клітин, так і в організмі експериментальних тварин на моделі РНК- (вірус везикулярного стоматиту) та ДНК- (вірус простого герпесу) вмісних вірусів. Дослідження противірусної активності похідних дифенілу на клітинах, здатних продукувати ІФН у відповідь на дію індукторів, та на дефектних за цією ознакою клітинах Vero, дозволило виявити вклад як інтерфероніндукуючої, так і противірусної компоненти у виявлену активність сполук.

Активація класичного шляху інтерферонової відповіді пов’язана з різким зростанням функціональної активності білка MAVS та запуском сигнального каскаду реакцій через активацію IRF-3 та NF-κB, кінцевою ланкою якого є продукція інтерферону І типу. Гіперекспресія MAVS індукує експресію ІФН-α/β, посилюючи таким чином антивірусний захист. Для максимального антивірусного захисту організму необхідні одночасні запуски MAVS на пероксисомах та мітохондріях, при чому передача сигналу від органел відбувається незалежно одна від одної.

Проведені дослідження зміни мітохондріального мембранного потенціалу клітин, що свідчить про активацію MAVS-залежного внутрішньоклітинного шляху під впливом похідних дифенілу виявили істотне зростання мембранного потенціалу мітохондрій ΔΨм впродовж перших 30 хв. інкубації, а через 120 хв. після обробки клітин сполуками ΔΨм значущо не відрізнявся від контрольних значень. Тобто активація MAVS та запуск антивірусного сигнального каскаду реакцій відбувається на ранніх етапах взаємодії сполук та клітини.

Виявлено стимулюючий вплив сполук на зростання мітохондріального мембранного потенціалу, що є необхідною умовою функціонування мітохондріального антивірусного сигнального шляху, кінцевим етапом реалізації якого є продемонстрована продукція інтерферону І-го типу.

MAVS є основним елементом рецепторної системи RLR, яка забезпечує мітохондріально-опосередковану антивірусну відповідь. Функціонування олігомерного комплексу MAVS призводить до активації транскрипційних факторів NF-κB та IRF-3, в результаті чого відбувається експресія інтерферону-α/β. Передача сигналу за допомогою білка MAVS підтримується за умови зростання мітохондріального мембранного потенціалу. Відомо, що розсіювання мітохондріального мембранного потенціалу супроводжується пригніченням антивірусної відповіді клітин.

Беручи до уваги той факт, що у відповідь на вірусну інфекцію в організмі відбувається не лише активація системи інтерферону, а і запуск каскадних реакцій продукції різноманітних цитокінів, що модулюють загальну імунну відповідь, порівняльне вивчення рівня продукції прозапальних цитокінів-активаторів клітинної ланки імунітету: ІЛ-12 та ІФН-γ та їх антагоністів: ІЛ-4 та ІЛ-10 виявило значне зниження продукції ІЛ-10 та незначущого збільшення продукції ІЛ-12, у порівнянні з контрольними тваринами.

Початковий етап інтерфероногенезу, а саме взаємодія інтерфероногену з клітинною поверхнею та його роль у наступній передачі сигналу для експресії генів ІФН стали основою для проведених досліджень. Похідні дифенілу, як і препарат аміксин, завдяки своїй структурі здатні ефективно впливати на мембрану та легко проникати крізь неї. Важливу роль у цих процесах відіграє поверхневий заряд клітини, який приймає участь у регуляції значної кількості процесів, серед яких взаємодія клітин між собою та з позаклітинним матриксом, поділ клітин та їх диференціювання. Зміна величини поверхневого заряду призводить до порушення функції клітин та розвитку патологій.

Дослідження ранніх змін електрофоретичної рухомості Т-лімфоцитів миші показали, що дифеніли впливають на величину ЕФР, а отже і на поверхневий заряд клітин, утримуючи досягнуті показники впродовж 4 год спостереження. Тобто, представлені сполуки мають здатність корегувати величину ЕФР клітин, а отже і поверхневий заряд, при патологічному процесі. Виявлено вплив досліджених сполук на зміну потенціалу плазматичної мембрани, що дозволяє стверджувати, що похідні дифенілу шляхом модуляції поверхневого заряду можуть регулювати різноманітні ланки активаційної програми інтерферонової відповіді клітин та розглядати їх ефекти як мембраноопосередковані. Отже, взаємодія сполук з поверхнею клітин призводить до модифікації молекулярної структури їх плазматичної мембрани.

Взаємодія похідних дифенілу з певними структурами на поверхні клітин та мембранами мітохондрій забезпечує ініціювання каскаду реакцій, наслідком яких і є виявлені антивірусні та інтерферон-індукуючі ефекти досліджених сполук. На підставі вивчення впливу похідних дифенілу на зміну мембранного потенціалу мітохондрій вперше зроблено висновок про зв’язок інтерферон-індукуючої дії сполук з активацією білка MAVS, який є ключовою ланкою класичного шляху інтерферонової відповіді, необхідного для розпізнавання вірусних РНК. Отже, похідні дифенілу опосередковують свої функції саме через мітохондріальний антивірусний сигнальний шлях, що в результаті призводить до індукції ІФН І типу.

Отримані результати дозволили позиціонувати похідні дифенілу як такі сполуки, що здатні забезпечувати антивірусний захист клітин не тільки за рахунок активації продукції інтерферону; пов’язати їх антивірусну, інтерфероніндукуючу активність та мембранотропні властивості.

Суттєвим недоліком сучасних хіміотерапевтичних засобів є їх низька вибірковість дії та висока токсичність для нормальних клітин організму, що не дозволяє повністю елімінувати так звані «сплячі» стовбурові злоякісні клітини, що, як наслідок, призводить до швидких рецидивів пухлин і появи злоякісних клітин, стійких до хіміотерапії. Тому розробка і впровадження в клінічне використання нових протипухлинних препаратів, що націлені на специфічні онкобілки, а також володіють здатністю легко долати резистентність пухлин до ліків є ключовою необхідністю сучасної фармакології і онкології.

Гетероциклічні сірко- та азотовмісні сполуки, зокрема, 4-тіазолідони, є перспективною групою біологічно активних речовин, які володіють різною дією – протитуберкульозною, протизапальною, імуномодуляторною, а також протипухлинною (Kucukguzel et al, 2002). Незважаючи на це, молекулярні механізми дії цих сполук на клітини-мішені вивчені недостатньо (Kaminskyy et al, 2009). Унікальною особливістю 4-тіазолідонів є зручність хімічної модифікації їх молекул, що дозволяє додавати до базової структури цих сполук нові активні групи, які володіють різними біологічними ефектами (Havrylyuk et al, 2009). Співавторами даного циклу праць було синтезовано кілька тисяч речовин на основі гетероциклічних сірко- та азотовмісних сполук, що характеризуються різними хімічними замісниками в 5-му положенні молекули 4-тіазолідону.

Заявлені сполуки одержували взаємодією 3,5-діарил-4,5-дигідропіразол-1-карботіоамідів в умовах одностадійної реакції, що поєднує [2+3]-циклоконденсацію та реакцію Кньовенагеля з монохлороцтовою кислотою та відповідними лігандами-піразолінами, бензтіазолом, ізатинами. Реакцію проводили в середовищі оцтової кислоти в присутності двократної кількості безводного ацетату натрію.Синтезовані сполуки є червоними кристалічними порошками, розчинними у ДМСО і ДМФА, малорозчинними в оцтовій кислоті, нерозчинними в спирті, ацетоні, воді та ефірі. Для доказу складу і структури синтезованих сполук були використані відомі фізико-хімічні методи, зокрема ПМР-спектроскопія та елементний аналіз. Одержані результати свідчать про відповідність синтезованих сполук заявленим.

Результати ґрунтовного скринінгу протипухлинної активності на 60 лініях злоякісних клітин людини, проведеного на базі Національного інституту раку США, свідчать про високу ефективність досліджуваних сполук, на що вказує діапазон ефективної інгібуючої концентрації 0,12 ÷ 8,05 мкМ. За результатами in vitro скринінгу сполуки, що заявляються, були відібрані для вивчення токсичності in vivо і виявились нетоксичними. Таким чином, сполуки, що заявляються, проявляють високу протипухлинну активність в мікромолярних концентраціях і є перспективними протипухлинними засобами.

На одному з етапів досліджень нами було вивчено протипухлинний потенціал трьох різних похідних 4-тіазолідонів Les-3120, Les-3166, Les-3372 та показано, що відмінності у хімічній структурі їх бічних груп відіграють визначальну роль в індукції специфічних сигнальних шляхів клітинної смерті (апоптозу) цими сполуками у злоякісних клітинах. Однак власна антинеопластична активність досліджених 4-тіазолідонів все ще суттєво (в 5-10 разів) поступається протипухлинним препаратам, які вже тривалий час застосовуються у клінічній практиці (доксорубіцин, вінкристин). У співпраці з співвиконавцями даного проекту з Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького нами було проведено оптимізацію хімічної структури вихідних сполук, ґрунтуючись на результатах попередніх досліджень їх біологічної активності. В результаті цієї роботи було синтезовано дві ізомерні «гібридні» сполуки Les-3661 та Les-3713, що містять у своїй структурі елементи вихідних сполук Les-3120 та Les-3372.

Поєднання двох бічних груп з різними біологічними активностями в одній молекулі 4-тіазолідонів привели до комбінування їх молекулярних шляхів індукції апоптозу. Такі гібридні молекули не лише проявляють на порядок вищий антинеопластичний ефект, ніж їхні попередники, але й значно швидше індукують апоптоз в клітинах- мішенях. Місце приєднання бічних груп в тіазолідоновому ядрі теж відіграє важливе значення у реалізації протипухлинного потенціалу новітніх «гібридних» 4-тіазолідонів. Зокрема, препарат Les-3661, яка є 4-заміщеним тіазолідоном, демонструє 5-10 кратне зростання протипухлинної активності порівняно з вихідними сполуками, тоді як його цитотоксична активність 2-заміщеного ізомеру Les-3713 нижча в 20 разів порівняно з Les-3661.

Синтетичне похідне 4-тіазолідонів Les-3661 володіє вираженою протипухлинною активністю in vivo на двох моделях мієлоїдних пухлин – мишачій лімфомі NK/Ly та лейкозі L1210, продовжуючи тривалість життя тварин-пухлиноносіїв в 1,6-2,5 рази залежно від моделі пухлини. Препарат Les-3661 призводить до загибелі пухлинних клітин in vivo шляхом індукції в них апоптозу мітохондріального типу, що підтверджує раніше отримані молекулярні дані in vitro, та вказує на перспективність його подальших доклінічних досліджень на експериментальних тваринах.

На наступному етапі досліджень було модифіковано структуру препарату 3166, замінивши арильний фрагмент на бензтіазольний (сполука 3506). Це дозволило не лише вдвічі посилити протипухлинну активність новітньої сполуки 3506, але й значно пришвидшити індукцію апоптозу. Із застосуванням сучасних методів оцінки мітохондріального мембранного потенціалу, розроблених співвиконавцями даного проекту з Інституту монокристалів НАНУ, показано, що причиною такого посилення проапоптичної активності «гібридної» сполуки 3506 є суттєве зростання її прооксидантної активності, що проявляється у ранньому 3-кратному зростанні рівня супероксид-аніонів вже на 1 годину після додавання до культури клітин. Як відомо, АФК також задіяні в індукції та регуляції сигнальних шляхів апоптозу злоякісних клітин (Simon et al, 2000; Kaminskyy et al, 2013). Цей процес супроводжується швидкою деполяризацією мітохондрій і активацією мітохондріального шляху індукції апоптозу, опосередкованого касапазою-9, вже на 6 годину дії. На відміну від нього, сполука 3166, яка містить у аналогічному положенні арильний фрагмент, не лише володіє вдвічі слабшою цитотокиснчою активністю, але й призводить до значно слабшої і пізнішої індукції АФК (на 6 годину) та активації мітохондріального апоптозу лише на 12 год дії. Отже, наявність специфічних бічних груп у структурі 4-тіазолідонів має визначальний вплив на швидкість та потужність індукції цими сполуками оксидативного стресу у клітинах-мішенях, що прямо корелює з інтенсивністю загибелі пухлинних клітин за дії досліджуваних сполук.

В ряді випадків продукція АФК за дії ліків, крім протипухлинної дії, може проявляти і ряд негативних побічних ефектів. В зв’язку з цим досліджено комбінаторну дію in vitro та in vivo новітніх антиоксидантів на основі діоксиду церію та протипухлинних препаратів доксорубіцину і цисплатину, які реалізують свою антинеопластичну активність шляхом інтеркаляції в структуру ДНК і продукції активних форм кисню (АФК) (Berndtsson et al, 2007; Minotti et al, 2004). Обидва протипухлинних препарати володіють вираженою кардіо- і нефротоксичністю, що суттєво обмежує їх застосування у лікуванні пухлин (Menna el al, 2012) і зумовлена гідроксил-радикалами, які утворюються за присутності заліза (ІІ) із супероксид-аніонів, продукція яких індукується даними препаратами (Cepeda et al. 2007: Minotti et al, 2004).

Показано, що антиоксиданти модулюють дію доксорубіцину на клітини карциноми прямої кишки людини лінії HCT-116, пригнічуючи його цитотоксичну активність на 20-30% залежно від концентрації. Комбінована дія сполук в тих же концентраціях ніяк не захищала клітини субліній HCT-116/Bax (-/-) та HCT-116/р53 (-/-), дефектних по генах p53 і Bax, задіяних в регуляції апоптозу, від доксорубіцину, а навпаки, посилювала його дію. Отже, антиоксиданти захищають від токсичної дії доксорубіцину лише умовно нормальні клітини, тоді як комбінація цих сполук з доксорубіцином лише посилює його дію як пухлинні клітини з дефектами в структурі генів Вах та р53. Аналогічні результати отримані на моделі лейкозу людини лінії HL-60 та її резистентної до ліків сублінії HL-60/vinc, яка характеризується надекспресією Р-глікопротеїну. Це вказує на цитопротекторну активність досліджуваних антиоксидантів щодо клітинних ліній, які чутливі до дії ліків, і зворотній ефект (посилення дії протипухлинних препаратів) цими сполуками на моделях злоякісних клітин, які резистентні до лікарських засобів. Такий унікальний дуалізм матиме надзвичайно важливе значення в клінічній практиці, оскільки їх застосування в складі схем хіміотерапії онкохворих дозволить знизити побічні ефекти дії протипухлинних препаратів на нормальні клітини організму і посилити її щодо злоякісних клітин, резистентних до дії ліків. Результати експерименту підтверджені методом аналізу продукції супероксид-радикалів (пряме визначення супероксид-аніонів із використанням специфічного барвника дигідроетидію (DHE) та флуоресцентної мікроскопії) у клітинах аденокарциноми молочної залози лінії MCF-7 за дїі доксорубіцину та вищезгаданих антиоксидантів. В усіх випадках спостерігався виражений інгібіторний ефект антиоксидантів на рівень АФК у клітинах-мішенях.

Отримані результати щодо пригнічення побічних ефектів доксорубіцину, зумовлених надпродукцією АФК, були верифіковані in vivo на щурах. Показано, що застосування новітніх антиоксидантів на основі діоксиду церію знижує активнгість сукціинатдегідроденази та нормалізує кількість ацил-КоА в печінці піддослідних тварин до контрольного рівня за дії доксорубіцину. Це вказує на зниження гепатотоксичності доксорубіцину in vivo, а отже – кращий прогноз для виживання тварин, які проходять курс лікування цим ефективним, але дуже токсичним протипухлинним антибіотиком.

На завершальному етапі досліджень доксорубіцин було іммобілізовано на новітньому наноносії – фулерені С60, який не лише може використовуватися як ефективна платформа для направленої доставки ліків у пухлинні клітини, але й володіє власною антиоксидантною активністю. Показано, що фулерен С60 в 1,5-2 рази посилює протипухлинну активність доксорубіцину до злоякісних клітин, в т.ч. тих, які є резистентними до дії ліків, в той же час знижуючи оксидативний стрес, індукований цим антибіотиком. Дослідження на моделі карциноми Льюїс у мишей показали, що фулерен-доксорубіцинові комплекси володіють в 2-2,5 рази вищою протипухлинною активністю у порівнянні з нативним доксорубіцином, що вказує на потужний синергічний ефект від іммобілізації цього препарату на фулерені С60 та перспективність застосування новітніх платформ для доаствки ліків із власною антиоксидантною активністю у клінічній медицині.

Таким чином, цикл робіт включає як розробку інноваційних методів отримання та застосування нових речовин з противірусною та протипухлинною дією, нанобіокомпозитів на основі наночастинок та біологічно активних сполук, так і високочутливих тестів для діагностики функціонального стану біооб’єктів, що дозволяє адекватно оцінювати ефективність їх дії.

Результати досліджень за темою роботи викладено в 95 статтях (в т.ч. 29 у зарубіжних журналах) та 141 тезах доповідей. Загальний індекс цитування публікацій складає 338 (згідно баз даних Scopus), h-індекс =11. За результами роботи отримано 6 патентів.

Результати циклу мають важливе прикладне значення для наступних масштабних доклінічних досліджень з метою розробки нових стратегій терапії пухлинних захворювань людини та впровадження вітчизняних нових перспективних та ефективних поліфункціональних противірусних препаратів з інтерфероногенною активністю.

База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка
Інформація Автореферат Анализ Диплом Додаток Доклад Задача Закон Занятие Звіт Инструкция

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий